WB常见问题及对策

一、不好看的条带

1.不好看的条带大多是因为蛋白酶降解，造成条带出现在奇怪的位置。建议使用已经保存在冰上的新鲜样品或换抗体。

2.如果蛋白质位置比较高，重新加热样本可以帮助打破蛋白质的结构。

3.模糊的条带经常是因为转染过程中电压过高或气泡，应确保凝胶在较低的电压下运行，以及转染的三明治避免产生气泡。另外，换新的电泳缓冲液可能也可以帮助解决问题。

4.条带不平滑，可能是由于阻力低导致穿过蛋白质凝胶的速度过快，因此要选用质量较好的样品。

5.白色条带是由于蛋白质或抗体太多了。

二、条带缺失

1.一抗或二抗有问题。

2.抗体浓度太低。

3.有些抗体不能用于WB。

4.转膜液、TBST、电泳缓冲液或ECL比较陈旧或有质量问题。

5.抗体中加入了叠氮化NA， 干扰ECL发光。

三、 目的蛋白信号弱

1.条带信号弱可能是抗体或抗原浓度低造成的，可以尝试增加曝光时间。

2.另一个原因可能是脱脂奶粉掩盖了抗原。在这种情况下使用BSA 或减少使用的牛奶量。

四、背景过高

1.高背景通常是由于与PVDF膜结合的抗体浓度过高造成的。

2.另一个可能是缓冲液太旧。可以试试多洗一会。

3.曝光也可能导致背景过高。建议试试不同的曝光时间来找到最佳时间。

五、条带上的斑点

1.条带上出现斑点可能是转膜的问题。如果有气泡出现在凝胶和膜之间，会在条带上显示很暗的影，因此赶气泡是很重要的。

2.洗背景是至关重要的。

3.可能是由于二抗的聚合，在这种情况下，二抗可以离心并过滤以去除聚合体。

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