神经 HRP 示踪显色液(TMB 法)
产品简介:
上个世纪70年代,Kristensopn 和Olsson报道了HRP可神经末梢摄取,经轴浆逆行运输至神经元胞体,经组织化学方法可显示出神经元的轮廓,从而开发出HRP追踪神经元示踪技术,即为HRP法。3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)是非常优越的酶免试验显色剂,能溶解于多种有机溶剂和双蒸水中,为稳定的无色溶液,不适量过氧化脲或双氧水不缓冲液混匀后,不过氧化物酶作用产生清晰的蓝色产物,极易观察,在辣根过氧化物酶的催化下 , TMB 会产生蓝色沉淀,该沉淀不溶于水和乙醇,显色后呈蓝色,可在显微镜下观察。神经 HRP 示踪显色液(TMB 法)是动物经麻醉、注入 HRP 后,游离或络合型的HRP不氧化剂反应生成络合物,该络合物氧化供氢的TMB显色剂,呈蓝色,在显微镜下清晰可见,该检测法DAB法灵敏。该显色液仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。
产品组成 |
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50T | |
试剂(A): TMB assay buffer | 2×500ml | RT 避 光 |
试剂(B): TMB 显色液 | 30ml | -20℃ 避 光 |
试剂(C): TMB 增强剂 | 2×1ml | RT |
试剂(D): TMB Wash buffer(20×) | 100ml | RT |
操作步骤(仅供参考):
1、动物麻醉:多用(3.5%)戊巴比托妥钠作为麻醉剂,大鼠的麻醉剂量为0.25-0.35ml/100g。
2、导入HRP:有压力注射法、电泳法以及周围神经系统的注射涂抹等法。
3、确定动物存活期。
4、动物灌注:麻醉后,经左心室升主动脉插管行心内灌注固定。先用生理盐水或PBS快速灌注。随后用4%的多聚甲醛固定液灌注,先快后慢,时间控制在30-40min。最后用10% 蔗糖磷酸缓冲液(pH7.4)。
5、取材:取组织置于 20%的蔗糖磷酸盐缓冲液中,切片厚度40μm,存于蔗糖磷酸盐缓冲液备用。
2、配制TMB显色工作液:取适量的TMB 孵育液和TMB 增强剂,按TMB孵育液:TMB 增强剂=2000~8000:1 的比例混合(具体比例应根据具体时间摸索确定),即为TMB 显色工作液,即配即用,不宜保存。
3、配制 1×TMB Wash buffer:取适量的TMB Wash buffer(20×),按TMB Wash buffer: 蒸馏水=1:19 的比例混合,即为1×TMB Wash buffer。室温保存,6 月有效。
4、切片用蒸馏水清洗 3 次,每次 2min。
5、切片入10ml TMB 孵育液(提前 20℃温育),避光孵育20min,其间不断晃动。
6、切片入10ml TMB 显色工作液(提前 20℃温育),避光孵育20min,其间不断晃动。7、漂洗:取 10ml 左右的 1×TMB Wash buffer 漂洗切片 2-3 次,每次 5min。
8、贴片,载玻片用铬明矾明胶包被,室温空气干燥。
9、脱水、透明步骤按如下操作:
①蒸馏水 10s
②70%乙醇 10s
③95%乙醇 10s
④100%乙醇 2 次,每次 10s
⑤二甲苯 2 次,每次 2~5min。
注意事项:
1、如果出现高的反应背景或沉淀,表明 TMB底物反应过于强烈。
2、所用器皿必须洁净,避免含有氧化剂或还原剂,否则会产生非特异性反应。
3、TMB显色液避免反复冻融,以免显色效率下降。
4、TMB增强剂注意密闭保存,否则显色效率下降。
有效期: 12 个月内有效。