细胞培养的基本知识

操作前准备工作：

1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒：1)高压蒸汽灭菌15分钟以上；2)干烤消毒140度2小时以上；

2.无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上；各种培养板照射3小时以上；

3.培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验：将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置-20度保存；

4.消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20度保存；

5.各种冻存的液体复温时应边摇边融化，否则有的液体（特别是培养基）容易产生沉淀；

6.培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外线的应照射1小时以上，如有高温灭菌的应按程序来菌）至少每月一次；

7.进入操作时应注意先清洗双手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作时注意无菌台内空间层次。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，如果数量较多，培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作，瓶与瓶之间应相隔一定的距离，开瓶（盖）时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧，开开后应用灯先烧口，然后烧盖用完后同样操作，整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。

复苏：

1.应遵守慢冻快融的原则，先将水温锅调至37-37.5度，取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化；

2.在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内，约5ml左右，然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞，置培养并内轻轻摇晃，使细胞均匀后置培养箱内培养。

传代：

1.贴壁细胞：

对于贴壁细胞应先吸（倒）尽培养基，吸的越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱，50ml培养瓶加入消化液约0.6ml，按此比例进行消化，（根据配制强度经验），晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入完全培养基后继续培养或实验。

2.悬浮细胞：

一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心500rpm，5min后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。

无菌操作：

简要介绍：

1.将试验用品放入超净工作台用紫外线照射30分钟；2. 照射30分钟后，进入缓冲间，换灭菌的无菌衣，换专用拖鞋；3.手部用5％的洁尔灭浸泡2分钟，进入洁净区后，用75％的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩；5.操作时尽量靠近火焰；6.装培养基的瓶子等不要直接口向上，用一个架子斜放，瓶口朝向火焰；7.标准操作，不要让无菌吸管到处碰来碰去；8.中途出入无菌室，再次操作时，一定要再次用75％的酒精棉球消毒。

活细胞计数：

1、先消化吹打使细胞尽量变成单细胞悬液；

2、取出细胞液按你的浓度加入台盼兰置室温5分钟左右；

3、准备好洁净的计数板及盖玻片放在一旁，用玻璃滴管吸取染好并轻轻吹匀的细胞液，将滴管尖端轻轻靠在盖玻与计数板的缝隙间，微微捏一下滴管胶头细胞自动就被吸到计数板里了（捏重了细胞不均匀，计数不准，细胞还会流出）。

4、在镜下计数。

四角的4个大方格内细胞总数÷4×10000=你滴入时细胞液每ml的细胞数。

从2011年开始我们致力于在生命科学领域、生物医学实验技术及论文润色服务，协助客户各类实验服务及论文润色十余年，是客户您值得信赖的科研合作伙伴!

如果您受时间、试验条件等限制而无法完成您的课题研究，欢迎您与我们联系。

实验技术服务：