BCA蛋白浓度检测

一、实验原理

BCA与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂混合一起即为BCA工作试剂。在碱性条件下， BCA工作液与蛋白质结合时，蛋白质将二价铜离子还原为一价铜离子， 一个一价铜离子螯合两个BCA分子，工作试剂变色，在562nM处有高的光吸收值，并与蛋白质浓度成正比，据此绘制标准曲线，检测蛋白的OD值，即可得到浓度值。

二、应用范围

1. BCA法测定蛋白浓度可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween20、60、80。但本试剂盒受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇(DTT)低于1mM，β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)低于0.01%。（tips：认真看说明书， 不仅是BCA检测试剂盒说明书， 还有蛋白裂解液说明书， 清楚裂解液的试剂配方， 如果不适用BCA法，可以考虑其他方法测定蛋白浓度）

2. 灵敏度高， 检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl。

3. 在50-2000μg/ml浓度范围内有较好的线性关系，因此样品浓度过高需适当稀释。

三、实验准备

1. BCA蛋白浓度测定试剂盒

2. PBS缓冲液

3. 96孔板

4. 酶标仪

5. 37℃恒温培养箱

四、试剂配置

1. 蛋白标准品： 5mg/ml BSA

完全溶解蛋白标准品，取5mg/ml BSA蛋白标准品10μl，加入90μl的PBS稀释为0.5mg/ml BSA（Tips：稀释后的0.5mg/ml BSA蛋白标准可以一次全配好，分装后-20℃长期保存）。

2. BCA工作液配制

根据样品数量和重复次数， 200μl每孔计算所需工作液的体积。 BCA工作液按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量，充分混匀（Tips：由于加样误差适当多配一些，配好的BCA工作液室温在24小时内稳定，因此可以在提蛋白前配好）。

五、实验操作

1. 蛋白标准品浓度梯度配制

2. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20μl，需加PBS补足到20μl。（Tips：记录加入待检测样品的体积）

3. 各孔加入200μl BCA工作液， 96孔板震荡30sec，37℃恒温培养箱放置30分钟。（Tips：也可以室温放置2 小时。 BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间）

4. 用酶标仪测定562nM的吸光度（Tips：也可以使用分光光度计测定）。

5. 以蛋白含量(μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线，根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

六、常见问题

1. 测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化。可能的原因是样品中含有严重干扰BCA法测定蛋白浓度的物质。

2. 建议每次测定时都做标准曲线。因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则如需精确测定宜每次都做标准曲线。

3. 一般提取的蛋白浓度应该在多少μg/μl？组织在1-30μg/μl，细胞低一些大概0.1-10μg/μl。

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