卡那霉素酶联免疫试剂盒说明书

药物概述及检测原理

卡那霉素是氨基糖甙类药物，被广范应用于动物疾病的治疗，由于其具有神经毒性和肾脏毒性，欧美国家及我国均要求其*使用。

本公司的卡那霉素酶联免疫试剂盒使用新一代生物技术开发，具有方便、快速、灵敏等特点。

本试剂盒利用卡那霉素抗体与卡那霉素可产生特异性结合的性质，先在酶标板上预包被抗原，再加入标准品（样本）和卡那霉素抗体工作液，样本或标准品中的卡那霉素药物与包被抗原竞争卡那霉素抗体，后加入底物催化显色。此时显色深度与标准品（样本）中卡那霉素药物的含量成反比。

• 试剂盒内包含组分：

1. 标准品工作液：0 ppb、0.2 ppb、0.6 ppb、1.8ppb、5.4 ppb、16.2ppb，
2. 1 mL/瓶。
3. 96孔酶标板：1块
4. 卡那霉素抗体工作液：1瓶（7mL/瓶）
5. 酶标二抗工作液：1瓶（7mL/瓶）
6. 20×浓缩洗涤液：1瓶（30 mL/瓶）
7. 20×浓缩组织复溶液：1瓶（10 mL/瓶）
8. 10×浓缩蜂蜜复溶液：1瓶（10 mL/瓶）
9. 底物A液：1瓶（7 mL/瓶）
10. 底物B液：1瓶（7 mL/瓶）
11. 终止液：1瓶（7mL）
12. 说明书
13. 盖板膜

• 用户需要自备的设备和试剂

仪器：

1. 酶标仪（检测波长450 nm、630 nm）
2. 电子天平（精度：0.01 g）
3. 离心机（4000 g及以上）
4. 生化培养箱（可调25℃）
5. 摇床
6. 旋涡振荡器
7. 微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排枪）
8. 计时器

试剂：（试剂均为分析纯）

1. 氢氧化钠
2. 氯化钠
3. 氯化甲钾
4. 磷酸二氢钾
5. 十二水合磷酸氢二钠
6. 去离子水

• 试剂盒特异性

　　　试剂盒与其他药物的交叉反应率：

1. 卡那霉素………………………100%
2. 大观霉素、链霉素、替米考星…＜0.1%

• 样本检测步骤

1. 工作液准备

1. 组织复溶工作液：取1份20×浓缩组织复溶液加去离子水19份按照1:19的比例稀释即得。
2. 蜂蜜复溶工作液：取1份10×浓缩蜂蜜复溶液加去离子水9份按照1:9的比例稀释即得。
3. 缓冲液: 0.1M PBS溶液(PH=10-11)  称取13.4g十二水合磷酸氢二钠.20g氯化钠.0.32g氢氧化钠.0.5g磷酸二氢钾.0.5g氯化甲钾加去离子水溶解定溶至500ml。

1. 1 M盐酸溶液：量取1ml浓盐酸加去离子水11ml溶解混匀即得。

1. 洗涤工作液：取1份20×浓缩洗涤液加去离子水19份按照1:19的比例稀释即得。

1. 样品前处理

组织（鸡肉、猪肉）（稀释倍数：20）

• 称取1.0±0.05g均质样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入3ml缓冲液（见配液5.1），上下颠倒振摇5min；
• 放入60℃水浴环境中60min后，取出4000g以上，室温离心10min；
• 移取上清液100ul，加入400ul组织复溶工作液（见5.1）中涡旋20s；
• 取50ul用于分析。

蜂蜜（稀释倍数：15）

• 称取1.0±0.05g蜂蜜样本至50ml塑料离心管中；
• 加入2ml 去离子水，强烈震摇2min （或使用涡动仪涡动1min）；
• 取100μL上清液至400μL蜂蜜复溶工作液（见5.1）中，充分涡动30s；
• 取50 μL液体进行分析。

   液态奶样本方法一（稀释倍数：10）（同四环素液态奶方

   法一致）

• 将采样好的液态奶样本解冻后于室温静置平衡30min以上；
• 将枪头伸入原奶样本下层，小心取出1ml样本加入2ml离心管中（注意：尽量不要取到上层的奶油）；
• 加入50μL 1M盐酸（见5.1），强烈震摇1min （或使用涡动仪涡动30s）；
• 使用离心机室温4000 g以上离心10 min；
• 取上层清亮液体50μL加入另一干净离心管中（注意：尽量不要取到上层的奶油），再加入450μL组织复溶工作液（见5.1），强烈震摇1min （或使用涡动仪涡动30s）；
• 取50 μL液体进行分析。

   液态奶样本方法二（稀释倍数：40）（同四环素液态奶方法

   一致）

• 量取50ul液态奶样品于1950ul组织复溶工作液（见5.1）中；
• 充分涡动1 min混匀；
• 立即取50ul进行检测。

1. 检测

• 准备：将要使用的酶标板条插入酶标板架上，并记录各标准品和样品的位置，为减小检测值波动建议做双孔平行实验（每个样本/标准品点两孔），未使用的酶标板条用自封袋密封后，保存于2-8℃环境中以防变质；
• 加样：向对应微孔中加入标准品工作液/样品溶液50 μL，向每孔中加入50 μL酶标二抗工作液，再向每孔中加入50 μL抗体工作液，；
• 孵育：轻轻振荡酶标板10 s，使孔内液体充分混匀后，盖好盖板膜于25℃避光反应20 min；
• 洗涤：取出酶标板后小心揭开盖板膜，倒出板孔中液体后，在每孔加 250 μL洗涤工作液，浸泡15-30s后倒掉洗涤工作液，然后再加入洗涤工作液重复洗涤3~4次后，将酶标板倒置于吸水纸上，用力拍干；
• 显色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必须按体积1:1充分混合，混合液在10 min内使用，切不可使用金属容器盛装、搅拌试剂以免底物变质失效）；
• 孵育：轻轻振荡酶标板10 s，使孔内液体充分混匀后，盖好盖板膜于25℃避光反应10 min；
• 终止：在反应后的微孔中加入终止液50μL/孔，底物液由蓝变黄表明终止成功。
• 读数：终止后的酶标板应在5 min内用酶标仪读数，建议使用450 nm、630 nm双波长读取酶标板吸光度值。

1. 计算结果

• 设各标准品（或样品）的吸光度平均值为B，零标准（浓度为0 ppb的标准品）吸光度平均值B₀以(B/B₀)×100%为各标准品（或样品）对应的吸光度的百分比：
• 使用半对数系统代入标准品对应的吸光度的百分比，与标准品浓度拟合出标准曲线。
• 将待检样品吸光度的百分比代入拟合出的标准曲线方程中，即可得出样品对应的浓度，后乘以样品相应的稀释倍数，即可得出样品中检测物含量。

• 试剂盒参数

• 试剂盒灵敏度：0.2 ppb；
• 标准曲线范围：0.2 ppb-16.2 ppb；
• 板内变异系数：<5%；
• 板间变异系数：<15%；
• B0吸光度理想值：>0.8；
• 回收率：90%±30%
• 样品低检测限：

　　　　猪肉、鸡肉…………约6ppb

　　　　蜂蜜…………………约5ppb

        液态奶样本方法一…约5ppb

        液态奶样本方法二约10ppb

注：ppb=ng/mL或ng/g。

• 分析限制

　　　本试剂盒为定量或半定量试剂盒，建议用于大量样本筛查分析。若检测结果为阳性，建议使用仪器方法开展确证实验（如GC/MS、LC-MS/MS等）。

• 试剂盒贮存条件

• 试剂盒贮存温度为2-8℃，切勿冻存。
• 未使用完的酶标板条须密封保存2-8℃的环境中。

• 注意事项

• 使用试剂盒前，请务必仔细阅读说明书。
• 试剂盒使用前，需将盒内各组份置于实验台上回温至室温（25±2℃）（提示：约1 h）。
• 试剂在使用前许摇匀，混合时应避免出现气泡。
• 枪头为一次性用品，为防止试剂交叉污染，检测过程中所用枪头不得重复使用。
• 请勿使用过期试剂盒，不同批号试剂盒中的试剂不得混用。
• 样品处理完毕后请立即分析，否则可能影响检测结果。
• 底物A液、底物B液均为无色透明液体，若在使用前已变成蓝色，或混合后立即变蓝，说明试剂已污染或变质。
• 加样过程在保证精度的前提下一定要迅速，以免反应时间差对检测结果产生影响。
• 终止液中含有硫酸，若不小心溅上皮肤或衣物请立即用大量清水冲洗。若不慎溅入眼，请在*清洗后去医院检查。

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