实验室经验之总结（四十五）：细胞培养常见问题解决！

1、如何储存和解冻血清才不会使产品质量受损? 

建议血清应保存在-2O℃。若一次无法用完一瓶，无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。将血清从冷冻箱取出后，置于2～8℃冰箱使之缓慢融解，一般是融解过夜。

 2、血清中包含絮状沉淀，它们是什么，怎么处理? 

沉淀主要成分是纤维蛋白和脂蛋白，不会影响血清品质。 首先让其沉淀在瓶子底部，中上层无沉淀血清直接转出使用，下层血清装到50ml无菌离心管，400g，离心3分钟即可除去 (一般不建议采用过滤的方法除去沉 淀，因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤)。

3、实验室如何选择适合的血清? 

稀有的澳洲血清培养娇贵细胞(小鼠ES、原代细胞分离培养)，南美血清或国产胎牛血清用于癌细胞、常规细胞系培养(用量大)，新生牛血清用于病毒包装(构建稳转细胞株)。

4、微生物培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗? 

一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

 5、有必要做热灭活吗?

实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或*没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。 若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量!

6、细胞培养中出现黑点是污染吗?如何处理? 

一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成，首先，要肉眼观察微生物培养基是否混浊，然后，在镜下观察培养细胞生长的状态，黑点是否游动。如果细胞被污染，微生物则会大量繁殖，微生物培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。 如果在镜下观察细胞，生长状态良好，与黑点出现前相比，没有任何变化，那么，黑点的出现可能与以下几种情况有关

(1)细胞生长过老，破碎的细胞残骸;

(2)血清质量不好，反复冻融的结果;

(3)配制培养基的pH值偏高，不宜细胞生长;

(4)培养原代细胞中出现小黑点，可能是原代组织中的杂质，多次传代可以消除。

 7、EDTA在细胞消化过程中起什么作用?

EDTA是一种螯合剂，它可以螯合Ca2+ 或Mg2+，而细胞表面很多和培养皿或培养瓶结合的蛋白都是带有Ca2+ 或Mg2+的，把这些离子螯合后，可以加速细胞和培养皿的脱离，促进消化。上皮类细胞的连接存在“桥粒”结构，是细胞间“牢固”的连接，但桥粒的形成依赖于钙离子的存在。在胰酶消化细胞时，加入EDTA，可以破坏细胞的桥粒结构，使细胞能够分散成单个细胞。通俗地说，就是破坏细胞间的粘连。

8、如何选用特殊细胞系培养基?

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。选DMEM做贴壁细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养。另外还可以参考ATCC的推荐信息。

9、 怎样让细胞适应新的条件?

从原条件逐渐过度：1/4、1/2、3/4，后是*新培养基。

10、为何微生物培养基保存于4℃，颜色会偏暗红色?

（1）.培养基内之CO2会逐渐溢出，造成微生物培养基越来越偏碱性。颜色也会随碱性增加而更偏暗红。

（2）.培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。需调整pH值至7.0~7.2. 11、细胞冻存管应如何解冻? 37℃，1~2分钟内全部融解。 冷冻管建议放在液氮液面上面，由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全(戴护目镜)，预防冷冻管之爆裂。

11、细胞冻存管应如何解冻? 可能原因：

(1)胰蛋白酶消化过度

(2)支原体污染

(3)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当

(4)细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)

(5)接种细胞起始浓度太低或太高 解决办法： 1． 准备一个培养容器，内装合适体积的适宜培养基，并使其温度和pH与建议的相称 。 2． 在37℃或该细胞系正常生长温度水浴下通过轻柔摇动迅速溶解冻存管（约2分钟）； 3． 管中内容物溶解后立刻将冻存管移到超净工作台内，并用70%酒精消毒表面防止污染，注意无菌操作。 4． 拧开冻存管盖，将管中内容物转移到已装有少量培养液的无菌离心管中稀释，离心（一般125g，10分钟），弃去上清并用1~2ml*培养基重新悬浮沉淀细胞，然后转移细胞悬浮液到培养容器内混合均匀。注意：如果冻存液中含5% DMSO，则不必离心，只需用15ml培养液悬浮即可。因为DMSO在这个浓度时没有毒性。 5．24小时后检查培养情况，如果需要的话进行扩传。有些细胞系（比如杂交瘤细胞）从冻存状态恢复需要几天时间。 实际上，一些杂交瘤细胞在天培养液中出现死亡细胞并产生许多细胞残骸。许多细胞冻存后活力下降并在融化后24小时到一个低状态。此后细胞将恢复并进入对数生长期。细胞复苏过程不是很难，主要是速溶这步很关键。再有，细胞复苏的状态如何，较大程度上取决于细胞冻存时的操作。还有一点，细胞也是有思想的，你对他好，关心他照顾他，他也不会让你失望的。

DC2.4小鼠树突状细胞    B-CPAP细胞培养说明书